藥學雜誌電子報112期
112
Vol. 28 No.3
Sep. 30 2012
中華民國一○一年九月三十日出版

複合奈米粒子胰島素載體之研究


再生藥局藥師 彭麗靜
靜宜大學應用化學所教授 黃克峰、官常慶
長庚大學生化生醫工程所教授 劉繼賢

摘要

罹患糖尿病有1.8億人口之多而且大約每年有290萬人口死亡,死亡率預計未來十年增加50%1。由於傳統治療上給予胰島素皮下注射之不便,故嘗試多種的基質做為給予胰島素之傳遞載體,對於解決注射胰島素疼痛之替代方法都很有興趣。若用蛋白質治療,給予經皮輸藥是一個方便的方法,所以經皮路徑提供有利於胰島素傳遞之另一種非侵入性的途徑。本研究主要是以配製幾丁聚寡醣 (chitosan oligosaccharide;COS) /牛血清白蛋白 (bovine serum albumin;BSA) 複合製成奈米粒子當胰島素之載體,來探討奈米粒子包覆胰島素之效率與體外之經皮穿透量。而 BSA/COS 複合奈米粒子是併用交聯劑 1-ethyl-3-(3-dimethyl aminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (EDC),藉由油包水型 (W/O) 奈米乳劑系統以相轉移溫度程序 (phase inversion temperature procedure;PIT) 和離心的方法製備而成,且胰島素可藉由靜電力吸附在複合的奈米粒子中。我們發現4% BSA,2% COS 與2% EDC 在 pH 5.5 反應二小時,可得到理想的奈米粒子。且其包覆胰島素的效率 (EE) 是88.5%。此胰島素的奈米粒子載體也顯示了成功的經豬皮穿透量,和持續的釋藥,結果顯示此複合奈米粒子具有作為胰島素經皮傳遞之潛能。

關鍵字: 經皮輸藥系統、幾丁聚寡醣、交聯劑、胰島素、奈米粒子

壹、前言

幾丁聚醣是由天然生物中所製取的生物高分子 (biopolymer),與生物體細胞有良好的生物相容性 (biocompatibility),不具有毒性且可以被生物體分解。由於具有生物活性,被視為最具潛力的生物高分子,尤其在生理上的調節機能也獲重視,包括抑制腫瘤組織之活性、促進傷口癒合等2-4。而且幾丁聚醣在藥物釋放控制近年來逐漸受各界之重視,藉由選用適當形態幾丁物質以及選用適當的藥物傳輸方式,可以控制並將藥物傳輸到目標點,進行藥物的靶定給藥 (drug targeting) 之目的4

經皮輸藥系統 (transdermal drug delivery system;TDDS),是一種藥物分子經由皮膚進入人體至全身血液循環,達到藥物傳輸的方法。此法比其他投藥路徑具有更簡易、方便、安全及局部藥物濃度高的優點,特別適合於如糖尿病這些需要多次重複給藥的疾病。然而,由於天然皮膚屏障的原因,大多數藥物分子通透皮膚的能力極差,大分子親水性藥物如胰島素 (insulin) 尤甚5

貳、材料與方法

一、試藥與儀器

(一)試藥

包括 Isohexadecane (純度>97%, Fanning, USA)、氯化鈉 (Merck, Germany)、幾丁聚寡醣 (YSK, Japan)、牛血清白蛋白 (Sigma, USA)、insulin glargine (Lantus 100 IU/mL, Aventis, Germany)、polyoxyethylene 2-lauryl ether (C12E2, HLB 6.0, Hoclean, Germany)、polyoxyethylene 4-lauryl ether (C12E4, HLB 9.7, Hoclean, Germany)、ispropyl alcohol (CH3CHOHCH3, Mallinckrodt, USA)、1- ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride (C8H17N3‧HCl, MW 191.7, Sigma, USA)、純水 (Millipore, France),和豬耳朵的皮 (台灣東盈農牧股份有限公司)。

(二)儀器

機械攪拌機 (IKA RW-20 Digital, Staufen, Germany, 500 rpm)、雷射粒徑儀 (Malvern Zetasizer ZS-90, Worcestershire, UK) with an argon-laser (λ 488 nm)、電導度測定儀 (Conductivity meter, WTW, Inolab 720, Burladingen, Germany)、紫外線可見光譜儀 (UV-Visible spectrophotometers, Type Surrise remote/touch screen, Australasia)、超高速離心機 (Centrifuge Kubota Model 3740, Japan)、循環冷卻機 (Firstek Model B401H, Taiwan)、冷凍乾燥機 (Freezemobile Kingmech Model 1450, Taiwan)、體外擴散玻璃裝置 (Franz diffusion cell, 台灣慶發玻璃儀器)。

二、實驗方法

(一)奈米粒子之製備與屬性

經水解處理過的2%幾丁聚寡醣,加入牛血清白蛋白各1% - 4%至20% w/w的水攪拌均勻,再以相轉移溫度程序得到最佳穩定性的油包水型 (W/O) 奈米乳劑6,是由界面活性劑 C12E2 和 C12E4 混合而成的,比率為 (6︰4)。在 HLB 值7.48,與油相70% w/w的 isohexadecane 所組成。最後再加入交聯劑2% EDC 維持500 rpm,在 pH 5.5,持續攪拌2小時後停止攪拌。將含奈米粒子的微乳劑立即置入-4 ℃ 的冷凍櫃中放置24小時,將此結凍的乳劑退冰之後,加入 ispropyl alcohol 3 CC,並以超高速離心 (12,000 rpm,30 min,15℃) 使油相、界面活性劑及水相分層,吸取油相棄之,保留水相,定量待分析。以去離子水反覆清洗奈米粒子3次之後,再以真空抽氣乾燥之備用。

(二)包覆效率的測量

將清洗後的 BSA/COS 複合奈米粒子 (1 mg) 加上 0.1 mL (0.364 mg) insulin 再加水至 1 mL 交聯2小時,讓 insulin 吸附在複合奈米粒子後,置入微量濃縮離心管中,於室溫下離心以低速離心 (4000 rpm) 10分鐘之後取上清液,樣品與分離程式時保留的水層皆用 UV-VIS 光譜儀分析含量,在 595 nm 所得的吸收度帶入檢量線中進行以 Bradford protein–binding assay 的方法進行蛋白質定量分析7,而 free 的定義為奈米粒子內的 insulin 藥物游離於水中之藥物量,即為奈米粒子未包覆之藥物量;依其包覆效率公式8

(三)體外經皮穿透

實驗裝置採用 Franz diffusion cell,於供藥端加入已交聯2小時 0.01 g 含有不同濃度 BSA/COS 複合奈米粒子和 1 mL (3.64 mg) insulin,而於受藥端加入 PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4) 緩衝溶液 5 mL 以及磁石,兩容器中間夾以角質層朝上之幼豬耳朵皮的厚度為350 μm 至400 μm,並將此裝置於32℃烘箱中維持恆溫9,以多磁點攪拌器控制轉速在 600 rpm,於1、2、4、6、8、10、12、24小時等特定時間點,將受藥端 5 mL 溶液全數抽出待測,並迅速注入5 mL 新鮮的 PBS 緩衝溶液於受藥端維持藥物最大穿透驅動力。假設其穿透效果僅由藥物的濃度 (drug concentration,C0) 及穿透係數 (permeability coefficient,Kp) 所控制,其穿透模式可以下列數學方程式描述10。Kp=Js/C0,其中Js為藥物穿透量 (permeability flux),假設實驗時 insulin 於 BSA/COS 複合奈米粒子之濃度 (C0,μg/mL) 及穿透量 (Js,μg/cm2.h) 皆維持固定,不隨穿透時間而變化,則以此方程式為工具所計算出之穿透係數 (Kp,cm/h) 可用以判斷 insulin 之穿透效率和計算複合奈米粒子中不同濃度的 BSA 為促進劑對 insulin 於皮膚穿透之影響比值 (enhancement ratio, Er)11

參、結果與討論

一、BSA/COS 複合奈米粒子載運 insulin 之包覆效率的測量

在圖一中顯示不同濃度 BSA/COS 複合奈米粒子 (1 mg) 載運 insulin (0.364 mg) 之包覆效率的比較,而此複合奈米粒子配製的條件是1% - 4% BSA 和2% COS 與 2% EDC 交聯2小時,在 pH 5.5,溫度為25℃,重覆3次之平均值所測得的包覆效率以 BSA 的濃度4%>3%>2%>1%,亦即包覆效率88.5%>84.3%>76.4%>69.7 %。亦表示 BSA/COS 複合奈米粒子載運 insulin 的包覆效率大約與複合奈米粒子中 BSA 含量成正比。

圖一 不同濃度的 BSA/COS 複合奈米粒子載運 insulin 其包覆效率的變化

二、BSA/COS 複合奈米粒子載運 Insulin 之體外經皮穿透的結果

在圖二中顯示不同濃度 BSA/COS 複合奈米粒子 (10 mg) 載運 insulin (3.64 mg) 之體外經皮穿透量的比較,而此複合奈米粒子配製的條件是1% - 4% BSA 和2% COS 與2% EDC 交聯2小時,再藉由體外擴散玻璃裝置儀器於600 rpm 的轉速,PBS 在 pH 7.4,溫度為32℃,重覆3次之平均值所測得的結果是 BSA 以4%>3%>2%>1% 的穿透量。且依 (表一),分析其經皮穿透係數 (Kp) 的變化,也顯現出 insulin 的穿透係數約與複合奈米粒子中 BSA 含量成正比,又由促進劑對 insulin 於皮膚穿透之影響比值 (Er) 得知複合奈米粒子中 BSA 含量增加,也可以促進 insulin 經皮的穿透量。

 

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圖二 不同濃度的 BSA/COS 複合奈米粒子載運 insulin 其體外經皮穿透量的變化

 

 

表一 不同濃度的 BSA/COS 複合奈米粒子載運 insulin 其體外經皮穿透量的參數

Formulation

Js (μg/cm2.h)a

Co (μg/mL)

Kp×10-2 (cm/h)a

Er

Insulinb

31.25 ± 2.48

3640

0.86 ± 0.068

-

Insulin + 1%BSA/COS

55.83 ± 2.38

3640

1.53 ± 0.065

1.79

Insulin + 2%BSA/COS

67.83 ± 2.89

3640

1.86 ± 0.079

2.17

Insulin + 3%BSA/COS

76.04 ± 2.55

3640

2.09 ± 0.070

2.43

Insulin + 4%BSA/COS

81.04 ± 2.08

3640

2.23 ± 0.057

2.59

a 重覆3次之平均值±標準差

b Insulin 被當成控制組

 

肆、結論

本研究的目的是藉由已知配方 isohexadecane/C12E2:C12E4 (3:2)/water 為70: 10:20 % w/w 粒徑小、分散指數也小的穩定 W/O 奈米乳劑系統6,來製備 BSA/COS 複合奈米粒子包埋胰島素,結果顯示以交聯2小時的4% BSA/COS 複合奈米粒子包覆胰島素效率88.5% 為最高,且胰島素經皮的穿透量也以4% BSA/COS 複合奈米粒子最多,亦即是 BSA/COS 複合奈米粒子載運胰島素之包覆效率與穿透量,幾乎是與複合奈米粒子中的 BSA 含量成正比。藉此評估所製備之複合奈米粒子作為 insulin 經皮輸藥系統緩釋載體的可行性。未來希望可以將複合奈米粒子設計成經濟、方便、多附加功能的載體,以便廣泛應用於各種藥物及有效成分的傳遞輸送上,期使各種藥物或有效成分在醫學、美容及食品之生物有效性能夠大幅地提高。

參考資料:

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Hybrid Nanoparticle Insulin Carriers

Li-Ching Peng1, Keh-Feng Huang2, Chang-Chin Kwan2, Chi-Hsien Liu3
Pharmacist of Zai Sheng Drugstore1
Department of Applied Chemistry, Providence University2
Graduate Institute of Biochemical and Biomedical Engineering, Chang Gung University3

Abstract

Diabetes mellitus (DM) is suffered by more than 180 million people and is responsible for approximately 2.9 million deaths each year. This mortality rate is expected to increase by 50% in the next decade1. Due to the inconvenience of the traditional treatment of diabetes by subcutaneous injection of insulin, various attempts are made in the vehicles for insulin delivery. Alternative painless methods to administer insulin are of great interest. Transdermal drug delivery is a convenient method for delivery of therapeutic protein since the transdermal route offers certain advantages among other non-invasive routes of insulin delivery. The aim of this study was to prepare the chitosan oligosaccharide (COS) and bovine serum albumin (BSA) hybrid nanoparticle for insulin delivery. The nanoparticle preparation, insulin encapsulation efficiency (EE) and in vitro skin permeation were systematically investigated. The BSA/COS hybrid nanoparticles were synthesized by using water-in-oil (W/O) nanoemulsion as the template and using 1-ethyl-3- (3-dimethyl aminopropyl) -carbodiimide hydrochloride (EDC) as the cross-linking agent. The hybrid nanoparticles were collected by using the phase inversion temperature procedure and centrifugation. Insulin could be adsorbed into the hybrid nanoparticles via electrostatic force. We found that the encapsulation efficiency of insulin on BSA/COS hybrid nanoparticles was 88.5%. The optimal procedure for nanoparticle preparation was 4% BSA, 2% COS and 2% EDC at a pH 5.5 condition reacted for 2 hours. The insulin-loaded nanoparticles showed a successful permeation through the porcine skin and the sustained release for insulin could be obtained. Our results highlighted the potentials of the hybrid nanoparticles for the insulin transdermal delivery.