摘要

本實驗主要目的在研究蛇床子素奈米粒子降血脂之藥效學，希望發展生物可降解性包覆方法，且大幅增加生體可用率的藥物劑型。蛇床子素的奈米粒子以高速均質法製備，包覆的材料為聚乳酸-甘醇酸，檢測包埋率及粒徑大小。在降血脂的藥效學方面，以敘利亞倉鼠為動物模式，為期八週的實驗，分為高脂肪食物、高脂肪食物合併蛇床子素奈米粒子及高脂肪食物合併 fenofibrate 三組。血液生化檢驗值顯示，fenofibrate 與蛇床子素奈米粒子可有效降低三酸甘油酯及總膽固醇；整體降血脂成效而言，fenofibrate 與蛇床子素奈米粒子幾乎不相上下。肝臟病理切片方面，fenofibrate 與蛇床子素奈米粒子可有效改善脂肪肝狀態。

關鍵字：蛇床子素、奈米粒子、高血脂、osthole、nanoparticles、hyperlipidemia

壹、前言

蛇床子 (Cnidium monnieri (L.) Cusson) 為繖形科 (Umbelliferae) 植物蛇床之成熟乾燥果實，主要產地為中國。蛇床子素 (osthole) 是蛇床子的指標成分之一，化學名7-methoxy-8-[3-methylpent-2-enyl]coumarin，分子式 C₁₅H₁₆O₃，分子量244.29，熔點：83-84℃，沸點：145-150℃，易溶於 methanol、ethanol、chloroform 與 acetone，不溶於水¹。

近年來國內外對於 osthole 的藥理研究範圍很廣，我們發現在抑制/改善脂肪肝形成方面有不錯的表現^2-6。但是 osthole 本身為超低極性化合物，幾乎不溶於水，口服生體可用率約27%⁷；因此，我們想要改善 osthole 的水溶解度，增加口服生體可用率。

對口服的低極性藥物而言，藥物的水溶解度是口服生體可用率的關鍵，也會影響其製劑處方的設計。為了改善其水溶解度，本實驗使用奈米粒子的方式，來大幅提昇 osthole 的極性，預期會使 osthole 的抑制/改善脂肪肝形成的效果很顯著。

貳、材料

一、藥品與賦型劑

蛇床子素 (Osthole)：Shaanxi Jintai Biological Engineering Co., Xi'an, China.

Fenofibrate：Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA.

實驗用囓齒動物標準飼料配方 (AIN-93G)：Soybean oil (5%), Cholesterol (0%), Dyets, Inc., Bethlehem, PA, USA.

實驗用囓齒動物高脂肪配方 (modified AIN-93G, high-fat diet, HFD)：Soybean oil (20%), Cholesterol (0.5%), Dyets, Inc., Bethlehem, PA, USA.

聚乳酸-甘醇酸 (poly (lactic-co-glycolic acid); PLGA)：Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA. (50%乳酸 + 50%甘醇酸)

二、化學試藥

二甲基亞碸 (Dimethyl sulfoxide, DMSO)：Tedia Company, Inc., Fairfield, USA.

聚乙烯醇 (Polyvinyl alcohol, PVA)：Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA

十二烷基硫酸鈉 (Sodium dodecyl sulfate, SDS)：Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA.

甲醇 (Methanol)：Tedia Company, Inc., Fairfield, USA.

參、方法

一、 Osthole 奈米粒子的製備及物化檢測

（一）奈米粒子的製備

油相組成為60 mg 的 osthole 與600 mg 的 PLGA 完全溶解在80℃的 DMSO 中，水相組成為3% PVA 及2% SDS 完全溶解在去離子水中，將水相倒入油相中，以高速均質機 (Silent Crusher, Heidolph Instruments GmbH & Co, Germany) 攪拌，轉速為20,000 rpm。隨即置於離心機中離心，轉速60,000 × g，去除上清液後以冷凍乾燥技術，即可獲得 osthole 奈米粒子。

（二）藥物含量

取1 mg 的 osthole 奈米粒子，以1L 移動相溶媒 (去離子水與 methanol 以18：82體積比混合) 稀釋，再以高壓液相層析儀 (Hitachi LaChrom Elite HPLC system; LiChrospher RP18 column 250 mm; Wavelength: 322 nm) 分析 osthole 濃度，即可計算出所得之 osthole 奈米粒子含有的 osthole 藥物量，以確定在爾後定量時，須取足量的 osthole 奈米粒子。

（三）粒徑大小

Osthole 奈米粒子先分散在 ethylene glycol (refractive index = 1.431，η=16.1 mPa‧s) 溶液，再置入雷射粒徑分析儀 (Coulter^TM LS-230, Small Volume Plus, Beckman, USA) 檢測槽，調整適當濃度後即可分析。

二、降血脂療效的動物評估

（一）動物的飼養及分組

動物實驗計畫由高雄醫學大學的實驗動物照護及使用委員會審核通過，五週齡的雄性倉鼠購自國家動物中心，先以 AIN-93G 預養一週，使其適應環境及飲食，再開始實施分組實驗。倉鼠隨機分為三組，第一組以 AIN-93G + HFD 飼養，第二組以 AIN-93G + HFD 並添加 osthole 奈米粒子飼養，第三組以 AIN-93G + HFD 並添加 fenofibrate 飼養。所有動物皆自由攝取 AIN-93G + HFD 及水，osthole 奈米粒子及 fenofibrate 以蒸餾水配置成 (懸浮) 溶液給予，飼養八週後犧牲。

（二）動物採血與摘取臟器

禁食十二小時後，以 ethyl ether 麻醉，從尿道口附近沿中線向上剪開至胸腔，以針筒由心臟直接採血，以1,000 × g 離心15分鐘，取上清液以-20℃冷凍儲存。另外，將肝臟完全切除，置入10% neutral buffered formaldehyde 中保存。

（三）三酸甘油酯/總膽固醇之測定

以 mercantile kits (Randox Laboratories Ltd., San Diego, USA) 進行分析，取10 µL 標準液或血清混和均勻，37℃水浴五分鐘，在波長500 nm 下以分光光度計測其吸光值，將血清與標準液的吸光值對照換算，即可得三酸甘油酯/總膽固醇之濃度。

（四）肝臟組織學觀察

將泡在10% neutral buffered formaldehyde 的肝臟取出，將多餘的液體瀝乾後，封存於加熱後的液態 paraffin，待冷卻固化後，製備約5 μm 厚度的切片，進行 hematoxylin & eosin 染色，於光學顯微鏡下觀察與照像。

肆、結果與討論

從高壓液相層析儀的分析結果來看，我們發現 osthole 奈米粒子的包埋率為75.39 ± 5.16%，表示我們的製備方法可以包埋一半以上的藥物。換句話說，我們製備的方法可以穩定地製作出 osthole 奈米粒子。

經由雷射粒徑分析儀檢測，我們發現 osthole 奈米粒子的粒徑為135.6 ± 8.9 nm，而未經奈米化的 osthole 粒徑為239.6 ± 7.6 µm。因此說明我們製備的方法是成功的，可以將240 µm 的粒子縮小至140 nm，足足縮減了1700倍。因為粒子越小其可接觸媒液的面積就愈大，也就導致溶解速率的增加。

三組倉鼠 (n=6)，餵食高脂肪飼料 (HFD)、HFD + osthole 奈米粒子及 HFD + fenofibrate 經實驗8週後，血清中總膽固醇 (TC) 及三酸甘油酯 (TG) 的變化詳列於表一。在實驗期間，我們另外發現倉鼠的身體外觀沒有明顯改變，行為模式也沒有特殊變化，至於體重的變化也沒有明顯差異。我們曾經對單純餵食 AIN-93G 的倉鼠進行血清中 TC 及 TG 的檢測，發現 TC 為95.1 ± 4.2 mg/dL，TG 為126.4 ± 6.1 mg/dL；而表一餵食 HFD 組的倉鼠，TC 為161.2 ± 7.4 mg/dL，TG 為213.8 ± 8.9 mg/dL，這證明我們誘導倉鼠罹患高血脂症是成功的。

 

表一 倉鼠服用 osthole 奈米粒子及 fenofibrate 經8週後，血清中總膽固醇及三酸甘油酯的變化 (n=6)

 

實驗進行8週後，餵食 HFD + osthole 奈米粒子及 HFD + fenofibrate 的 TC 值分別為96.2 ± 8.6及101.8 ± 5.7 mg/dL，比起 HFD 組都有明顯地降低，表示 osthole 奈米粒子及 fenofibrate 有降低 TC 值的效果。再看到 TG 值，osthole 奈米粒子及 fenofibrate 也有降低 TG 的效果，餵食 osthole 奈米粒子及 fenofibrate 的 TG 值分別為131.8 ± 10.7及144.4 ± 7.1 mg/dL，明顯地比 HFD 組來的低。

圖一是我們利用顯微鏡 (放大200倍) 來觀察倉鼠的肝臟檢體切片，(A) 是餵食 HFD 的倉鼠肝臟檢體切片，細胞核的周圍明顯有許多白色脂肪組織，這表示我們誘導倉鼠得到高血脂症是成功的。(B) 是餵食 HFD + osthole 奈米粒子的倉鼠肝臟檢體切片，可以明顯地發現細胞核周圍的白色脂肪組織只剩下一點，這說明了 osthole 奈米粒子對於抑制/改善脂肪肝形成的效果是很顯著的。(C) 是餵食 HFD + fenofibrate 的倉鼠肝臟檢體切片，同樣地我們可以發現細胞核周圍的白色脂肪組織也只剩下一點，這證明 fenofibrate 的確對於抑制/改善脂肪肝形成是有療效的。由上述的肝臟檢體切片觀察得知，osthole 奈米粒子及 fenofibrate 對於可以降低餵食 HFD 的倉鼠之脂肪肝形成的效果是很顯著的。

 

圖一 倉鼠的肝臟檢體切片之顯微鏡圖 (放大200倍)：(A) HFD，(B) HFD + osthole 奈米粒子，(C) HFD + fenofibrate

 

伍、結論

因為 osthole 本身屬於低極性，因此我們研發使用高速均質法來製備 osthole 奈米粒子，成功地改善 osthole 不溶於水的缺點。藥效學的研究也證實，osthole 奈米粒子在降血脂、抑制/改善脂肪肝形成的效果，幾乎可媲美 fenofibrate。換言之，透過製劑的改良與設計，可將原本差強人意的療效大幅地提升與改善。未來，我們可以開發 osthole 奈米粒子的相關藥品，對於治療高血脂症的效果應該也是非常的顯著，在臨床治療學上對於高血脂症的治療方式也多了一種新的選擇。

參考資料：

1. Maryadele JO: Osthole. The Merck Index，14th ed. Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, N.J., U.S.A., 2006:1188-9.

2. Song F, Xie ML, Zhu LJ, et al: Experimental study of osthole on treatment of hyperlipidemic and alcoholic fatty liver in animals, World J Gastroentero 2006;12:4359-63.

3. Sun F, Xie ML, Xue J, et al: Osthol regulates hepatic PPAR alpha-mediated lipogenic gene expression in alcoholic fatty liver murine, Phytomedicine 2010;17:669-73.

4. Sun F, Xie ML, Zhu LJ, et al: Inhibitory effect of osthole on alcohol-induced fatty liver in mice, Digest Liver Dis 2009;41:127-33.

5. Zhang Y, Xie M, Xue J, et al: Osthole improves fat milk-induced fatty liver in rats: modulation of hepatic PPAR-alpha/gamma-mediated lipogenic gene expression, Planta Med 2007;73:718-24.

6. Zhang Y, Xie ML, Zhu LJ, et al: Therapeutic effect of osthole on hyperlipidemic fatty liver in rats, Acta Pharmacol Sin 2007;28:398-403.

7. Zhou J, Wang S, Sun X: Determination of osthole in rat plasma by high-performance liquid chromatograph using cloud-point extraction, Anal Chim Acta 2008;608:158-64.